1901年徐锡麟出任绍兴府学校算学讲师，得到知府重用，后升为副监督。1903年赴日本参观大阪博览会，会中竟有中国古钟在展，徐锡麟愤感列强欺中国太甚。不久结识陶成章、钮永建等，在他们影响下，徐锡麟思想发生了巨大转变，逐渐放弃对清政府的希望，弃改良而从革命。当时，“《苏报》案”事起，日本留学生群起反对，徐锡麟也慷慨解囊，积极参与营救章炳麟。归国后，在家乡建蒙学、设书局，以期开启民智，因遭排挤，事竟不成，仍退任副监督之职。此时，俄人逼我远东，徐锡麟恸哭国弱受欺，于是投笔从戎，开始苦练枪法。

　　1904年初，绍兴城内大善寺地产被天主教觊觎，将至不保。徐锡麟得知后，抱病奔走，呼吁群众与教会作斗争，又积极发动绍兴各商号联名上书官府。因群情激愤，官府不敢包庇，天主教图谋终未得逞。该年冬，徐锡麟因事过上海，得遇蔡元培、陶成章，首批加入光复会，后成为光复会的主要领导人之一。回绍兴后，徐锡麟创办了大通师范学堂，罗致少年英俊，教以军法纪律，为革命培养人才。他还积极结交各地会党，甚至延请他们为学校教练。不久，徐锡麟借北上联络大盗冯麟阁之机，出山海关，过吉林、奉天，走西北边疆，查看了山川形势，并亲见日、俄在中国疆土上张狂角逐，愤愤不平，欲挥刀沙场“为国死”。

　　谋革命不易，为了达到反满目的，徐锡麟等人逐渐产生了“以术倾清廷”的思想，他们打算以捐官之法，使光复会的成员学习军事，乘机打入清廷内部，以掌握军权。于是他向清廷捐了一道员头衔，指分安徽候补。经多方活动，1905年冬，受绍兴徐克丞资助和徐锡麟表叔、湖南巡抚俞廉三推荐，徐锡麟与马宗汉、陈伯平各捐得官职，并被获准前往日本学习陆军。但到日本后，由于清廷驻日公使的阻挠，学习陆军的计划被破坏，无奈回国。

　　归国后， 徐锡麟等人又打算进一步打入官府，“藉权倾虏廷”。通过发动利用各方关系，徐锡麟谋得筹办安庆陆军小学之事。后因表叔俞廉三的推荐和徐锡麟本人的精明干练，终于得到安徽巡抚恩铭重用，光绪三十二年。冬季他到了安庆，向抚院落报到，恩铭接见后，派他为安徽 巡警尹。他小心逢迎，拜恩铭为师，恩铭引为亲信，又派他兼任巡警学堂会办。徐锡麟食清廷之禄，却时刻不改革命之志。1907年2月，徐锡麟与秋瑾约定在皖、浙同时举行反清武装起义。起义原定7月19日举行，因一会党人员在上海被捕，招供出革命党人的一些别名暗号，两江总督端方电令恩铭拿办。恩铭召徐锡麟计议，徐锡麟见自己别号在列，知事机迫人，遂决定于7月8日巡警学堂举行毕业典礼时举义。谁知恩铭这天有事，要求将毕业典礼提前两天，无奈起义只得于6日举行。外援不至，准备未周，起义堪忧。

　　6日，恩铭及文武官吏陆续齐集巡警学堂，毕业典礼开始.徐锡麟当时呈上毕业名册，口头报告了毕业官兵人数，随后市场说：“报告，今天有革命党人起事！”恩铭拍案高声说：“在哪里？什么人？”徐即应声说：“在这里，就是我。”话音没落，就朝恩铭连射数枪。大家夺门逃命。恩铭在被抬出去时喊叫道：“快把乱党就地正法。”于是藩台冯煦命令大家一齐集中到抚院。顾松也去了，他们集中在大堂后东边大厅里，忽闻上房内哭声震天，又见同仁医院院长、美国人戴世璜与拎着包的一行人匆匆走出，大家围上去打听消息，戴说”不中用了，身中六七枪，尤以右耳及腰部两颗子弹无法治理。“一会儿，人声又开始杂乱，几名士兵将徐锡麟反绑着押来了。他见藩台说：“大帅安否？”冯将脚一跺，说：“畜生，大帅待你何等恩厚，现被你枪杀，还敢问安否？”徐笑道貌岸然：“问大帅安问正是私谊也。”接着说：“枪杀恩铭，此乃正义也。”这时忽然传说“太太下来了。”宣称要将徐先剜心，后斩首。

　　公堂之上，面对审判，徐锡麟义正词严，怒斥清廷专政误国。清官质问徐锡麟：恩铭待你不薄，为何刺杀。徐锡麟厉言道：“恩抚待我，私惠也；我杀恩抚，天下之公也。”清官又问：汝常见恩铭，为何不于署中杀之。徐锡麟言：“署中，私室也；学堂，公地也。大丈夫作事，须令众目昭彰，岂可鬼鬼祟祟。”遂自写供词，愿一人承担责任，不牵连学生。

　　1907年7月6日，光复会成员安徽巡警处会办兼巡警学堂监督徐锡麟，在安庆刺杀安徽巡抚恩铭，率领学生军起义，攻占军械所，激战4小时，失败被捕，慷慨就义。审讯时挥笔直书：“蓄志排满已十余年矣，今日始达目的。本拟杀恩铭后，再杀瑞方、铁良、良弼，为汉人复仇。”

　　1907年7月7日，徐锡麟惨遭杀害，心肝被挖，用于炒菜。

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