宝庆二年（1226）进士，授新喻主簿。历知余干县、处州、镇江、隆兴府、太平州、临安府、建康府、江陵府及户部尚书、浙西安抚使、江东安抚使、宝章阁学士、明殿学士、资政殿学士等。
从真德秀学，宝祐三年（1255）累官至户部尚书兼知临安府、浙西安抚使；继加宝章阁直学士、沿江制置使、江东安抚使，知建康府兼行宫留守兼节制和州、无为军、安庆府三郡屯田使。
至建康，即以常例公用器皿钱20万缗支犒军民；削减租税，养鳏寡孤疾之人；招兵置寨，给钱助诸军婚嫁；属县税折收丝绵绢帛，倚阁除免以数万计；兴学校，礼贤才，僚属皆极一时之选。。为方便行人，他搜集旧名或起新名并亲书坊巷名匾额33处。宝佑五年，建康大雪，他自己捐钱30万缗赈济军民。
继调荆湖制置，知江陵府，建康百姓怀念不已。理宗闻知，命以资政殿学士、沿江制置使、江东学抚使衔，于开庆元年（1259）再任建康知府。
马光祖益思宽养民力，兴废起坏。免除前政亏欠钱百余万缗，罢减渔利税课，赐益于民。又修建明道南轩书院及上元县学。撙节费用，建平籴仓，贮米15万石，又为库贮籴本200余万缗，发粜常减于市价，以利于民。修饬武备，防拓要害，为政宽猛适宜，事存大体，边赖以安。继进大学士兼淮西总领，召赴行在，升提领户部财用兼知临安府、浙西安抚使。
时值岁饥，荣王府积粮不发。马光祖一连三日往谒才得见，对之厉声说：“天下孰不知大王子为储君，大王不于此时收人心乎?”王以无粮辞，马光祖取怀中文书，一一陈说某庄某仓贮粮若干，王语塞，得粮活民甚多。
进同知枢密院事。差知福州、福建安抚使。后以沿江制置、江东安抚使再知建康府。三次任建康知府，累计12年，威惠并行，百废修举。建康郡民为其建生祠6所。
咸淳三年（1267）六月，拜参知政事，五年进枢密使兼参知政事，以金紫光禄大夫致仕。
卒后谥“庄敏”。《宋史》卷四一六有传。
《宋史》记载，景定三年，京城临安发生饥荒，朝庭下诏账恤贫民，但集市上买不到粮食。时知临安府的马光祖知道理宗之弟的荣王府与立为储君的荣王之子的芮府，积有大量粟米，三次前往募捐，但荣王都辞以他事不见。马光祖没有办法，便躺在荣王府的客房里不走，荣王只好出来接见，马光祖厉声说道：“普天之下，谁不知道储君为大王子，今民饥欲死，为保不账恤以收人心？”荣王以仓储空虚相推，马光祖马上从怀里取出一张调查表，说：“大王某仓有粮若干，某某仓又有粮若干，此为调查之实情。”荣王一时语塞，只好许以30万斤粮账恤贫民，一时“活民甚多”。
《西湖游览志》里记载了马光祖的绝妙判词。说的是后来荣王晋升为福王，将福王府空余的房子出租给市民居住，只收房钱不修房子。有些胆大的居民看到房漏不修，就拒付房钱。福王府便派人至临安府讼民，马光祖调查后判道：“晴则鸡卵鸭卵（鸡蛋大鸭蛋大的洞透光），雨则钵满盆满。福王若要屋钱，直待光祖任满。”
更绝的是元·吴莱《三朝野史》里记载的马光祖判案的故事：一个书生翻墙进入所爱少女房间，被官府关押。马光祖一问案由，就出题《逾墙搂处子诗》面试，那书生秉笔疾书：“花抑平生债，风流一段愁。逾墙乘兴下，处子有心搂。谢砌应潜越，韩香许暗偷。有情还爱欲，无语强娇羞，不负秦楼约，安知漳狱囚。玉颜丽如此，何用读书求。”马光祖一见，大加赞赏，不但不责罚书生的非礼之举，反填一首《减字木兰花》词，判二人结婚：“多情多爱，还了平生花柳债。好个檀郎，室女为妻也合当。雄才高作，聊赠青蚨（指钱）三百索。烛影摇红，记取冰人是马公。”便令女方将女嫁生为妻，且厚赠嫁资，一时被市民传为京城佳话。此判词后被收入《全宋词》；此故事也被收录《情史》中，名叫《词判风流案成就美姻缘》；元杂剧中也有一出曲目叫《马光祖勘风尘》。
马光祖判案的故事还很多。 南宋分类汇编诉讼书判和官府公文的《名公书判清明集》中有一节《哗徒反覆变诈纵横捭阖》里记载马光祖提点两浙路刑狱、负责浙江一带司法审判期间，地方曾发生无赖之徒借死人事件大敲竹杠、大发不义之财的恶性案件：有个流丐胡四四跑进住在街道旁的居民曹十一家里乞讨，犯了叫化子不能进客堂的忌讳，被曹十一捆起来毒打了一顿。事隔近两个月后，胡四四因病死去，恰巧其血亲胡四三也来当地，以兴讼为能事的无赖娄元英便像是发现了宝货。娄先教唆胡四三上曹家吵闹，道是胡四四的死因乃遭彼毒打，伤重不治，威胁要告官；然后自己登门，愿为胡、曹息讼，充当和事佬。曹十一怕见官司，情愿拿出田产和钱财作陪「私了」，一切均由娄元英经手，狠捞了一票，旋将胡四四的尸体焚化。本来这事也就算完了，孰料焚尸时，被曹晖和曹升两人看见。娄元英怕他俩会告官，败露自己的劣迹，索性来个恶人先告状，又与胡四三连名具呈，控诉曹晖、曹升包庇曹十一打杀胡四四。马光祖审后写了判词说：“一开始教唆胡四四诈来的是你娄元英，继而卷起袖管发话捏合的是你娄元英，主张焚尸的又是你娄元英，最后公然具名诬告曹晖曹升的，还是你娄元英！按说胡氏之死，与娄氏有何相干？似这等无籍讹徒，别无手艺和工作，专靠搬弄词讼为生计，逐臭闻腥，索瘢寻垢，事情一到他手上，倒横直竖，全归他摆布，利益归他攫取，灾祸让别人承担。倘不痛加惩办，这社会风气的好转，从何谈起？”因此判决：娄元英脊杖十三，发配五百里外地方管押，并将其审判结果在地方张榜公布，让犯有类似过失的地痞浪人悔悟自新，洗心革面，从而达到安抚地方百姓的目的。此故事还收入出版的《六扇门(中国古代官匪斗争的传奇故事)》一书中，标题为《马光祖勇对难缠讼棍》。
宋·赵葵《行营杂录》中有《捕蛙陷夫》一文：说的是现今的浙江省丽水，宋朝时称为处州。当时的处州府颁布了一条规定，禁止村民捕捉青蛙。有一村民，无视官府禁令，到田野中逮捉青蛙，欲在城中销售以换取些银两。为对抗检查，他把冬瓜瓜蒂切一小口，掏去了内瓤，将捕获的青蛙藏于其中。黎明时分，他带着冬瓜镇定自若地准备进城。可刚到城门口，就被守城的士兵人赃俱获地抓了个正着。捕蛙村民被带到了大堂之上，对这种事实清楚，证据确凿的案件，官府本可依律令一判了之，可知府马裕斋（光祖）没有这样做。他好生感到奇怪的是，捕蛙村民如此巧妙的伪装，守城的士兵是如何识破的？为揭开心中疑团，马裕斋讯问了捕蛙村民。问：“你是什么时候捕捉这些青蛙的？”答：“是半夜”。问：“你捕捉青蛙一事还有谁知道？”答：“只有我的老婆知道”。于是，知府大人便差人将村民之妻传至大堂上问话。经过一番审讯，终于弄清了缘由。原来，捕蛙村民的老婆与他人私通，奸夫为霸占她，想出一陷害村民的歹毒之计，让她教村民如何捕蛙的同时，自己又向守城的士兵进行了举报。马裕斋遂将奸夫淫妇绳之以法。此故事也被明朝冯梦龙收入《智囊全集》里。